定量PCR仪的选购[转帖]

  荧光定量PCR的历史：
荧光定量PCR是PCR的一种。PCR仪目的为了基因扩增。在基因扩增中最重要的就是升降温过程，最早的PCR就是三个水浴锅,一个机械臂，定时抓出反应槽转换水浴锅。PCR的结果需要借助其他手段来检测。后来随着定量技术的发展，将PCR和检测做成一体，就形成了定量PCR仪。由于应用的是荧光技术，同时在每个扩增过程都能实施监控，所以标准的叫法为实时荧光定量PCR仪。准确的讲实时荧光定量PCR没有自动加样和标本处理系统，只能算半自动的。PCR仪简单的讲，就是一个温控设备和一个检测设备。
荧光实时定量PCR技术最早是在1992年由一位日本人Higuchi第一次报告提出的，他当时想实时地看到PCR反应的整个过程，由于当时EB（溴化乙锭）的广泛使用，最直接想到的标记染料就是EB，可以插入到双链核酸中受激发光，在PCR反应的退火或延伸时检测掺入到双链核酸中EB的含量就能实时监控PCR反应的进程，考虑到PCR反应的数学函数关系，结合相应的算法，通过加入标准品的方法，就可以对待测样品中的目标基因进行准确定量。这样，在普通PCR仪的基础上再配备一个激发和检测的装置，第一台实时定量PCR仪就诞生了。
而真正市场化的美国应用生物系统公司自1996年推出荧光定量PCR仪，ABI公司一直标称其推出了全世界首台荧光定量PCR仪
目前市面上有多家品牌，主要有ABI、Roche、Bio-Rad和MJ

荧光定量PCR的技术
定量PCR技术自产生以来，不断发展完善，到目前为止已经非常成熟了。标记方法由最初单一的染料法，发展到了特异性更高的探针法，如Taqman、Molecular Beacon、Fret等不同方法的标记探针，其中由于Taqman探针的广泛使用，实时定量PCR的方法也称为Tagman法。
在过去很长一段时间里，由于PCR检测的灵敏性和不稳定性，容易产生假阳性，国家对这种检测方法在临床上的应用是禁止的。但是随着荧光定量PCR技术的发展成熟和完善，特别是Taqman方法的广泛使用，使得荧光定量PCR以一种新的PCR检测技术得以在在临床检测上使用，如对病毒、病菌及其它致病微生物，致病基因的检测。
Taqman探针法具有高适应性和可靠性，实验结果稳定重复性好；由引物、探针序列和引物探针相互作用关系的双重保证克服了普通PCR的缺陷，现在国家对这方面的限制正逐步解开，目前正在规范相应的法律法规，为荧光定量PCR技术在分子诊断中的广泛使用做准备工作。
最常用的有三种检测模式：
１、R Green I检测模式。
2、Taqman探针法
3、杂交探针

荧光定量检测技术的优势
相对于抗原抗体法检测具有以下优势：
1. 研发方便，设计探针和摸定反应条件可以在短时间内完成，顺利的话，只需几次反应和几天的工作量就可以完成一种检测方法的建立。而拿到一个好的抗体至少需要一个完整的免疫周期，还不考虑筛选获得一个高特异性、高滴度免疫株的成功几率。
2. 检测灵敏度高，是一个基于PCR的信号放大检测系统。
3. 可以准确定量。

荧光定量PCR的应用
荧光定量检测技术在临床诊断方面很多，主要集中在各种病原体引起疾病的临床诊断，如肝炎类疾病、性病、与优生优育相关的疾病以及肺结核等等。
荧光定量PCR的应用不仅限于临床检测，在基础研究和海关、食品卫生检疫方面的应用前景都相当广泛。
基础研究中，对某一样品中目标基因含量的测定需求是相当广泛的，荧光定量PCR技术具有操作方便、反应快速的特点，可以对一些微量样品进行检测。所以在新药开发、超早期感染用药物及疗法的研究与开发、药物疗法研究、新诊断及检验试剂的开发、血液检验漏检率等方面，荧光定量PC技术有着广泛的应用前景。
在海关卫生检疫方面，进口的粮食、食品、花果是否安全，是否含有危险或潜在危险的成分，都可以用荧光定量PCR技术进行检测。一些瘟疫流行地区进口的相关食品也需要进行检测，比如前一段时间，欧洲流行疯牛病，日本流行猪口蹄疫，那么从这些地区进口相应的肉品及肉类加工产品，就要进行食品卫生检疫
在食品卫生检疫方面，如转基因食品，由于其是否安全目前尚无定论，因此有些国家明确规定转基因食品需要标签标识区分，我国也正在出台类似的法律法规。
此外一些生物类的恐怖袭击等，都可以用荧光定量PCR的方法进行快速检测。
所以荧光定量PCR最明显的对象主要是医院的检验科、中心实验室、临检中心、地方的疾病控制中心、生物技术公司、血液制品相关的部门。当然科研院所、学校是少不了的。

市场竞争情况：

现在国内国外荧光定量PCR仪的品牌不是很多，国内外品牌及产品代理商一览（见表一）
ABI美国应用生物公司：老牌的生物公司贵族，荧光定量PCR仪有四种型号的。其中5700、7700已停产；现在剩Prism® 7000荧光定量PCR仪、Prism® 7900高通量荧光定量PCR仪。ABI在中国有自己的办事处和销售人员。由于ABI是生物仪器的著名品牌，同时在产品推广方面有独到之处，所以其产品的销路一直很好。
ROCHE罗氏诊断：单一产品LightCycler，以科研定位为主。其很特色离心、气加热、毛细管等，设计另类，是最有特色的PCR仪。
罗氏其很多产品如诊断试剂，都进入医院，与医院的关系密切，在国内很多医院使用，市场做得很不错。
MJ Research：实时荧光PCR仪刚进入中国不久，孔间能使用不同温度是其特色。，其MJ Research在北京设立了办事处，其DNA Engine Opticon产品于2003年4月2日获得国家食品药品监督管理局的医疗器械准入证。
该公司系列产品早先是由基因公司代理，市场销售十分火爆，于2003年起正式由东胜公司独家代理。MJ的扩增仪在生命科研领域比较出名，加之东胜公司的擅长在学校和科研院所的推广，所以其荧光定量PCR在以实验为主体的研究领域占有重要地位。
伯乐： iCycler是其主打，进入中国已经比较久了，产品和5700一样，是扩增仪上加装定量模块而成，特点是价格较低。

生产商 型号 参考报价 代理销售商
美国应用生物系统公司 PRISM 7900高通量型 美国应用生物系统公司（上海）

7000型
瑞士罗氏诊断 LightCycler US$88,000 罗氏诊断产品（上海）有限公司
美国MJ Research公司 Opticon 东胜创新生物科技科技有限公司

Opticon2多色荧光
美国Bio－Rad iCycler iQ 伯乐分析生化仪器有限公司（上海）
美国Stratagene Mx3000P 安莱公司

Mx4000
Corbett Roter Cene-3000 基因公司
美国Cepheid公司 SmartCycler US$38000 上海皓嘉科技发展有限公司

英国HYBAID 不祥 广州三元科技有限公司

日本BIOER 齐全 上海华耀贸易有限公司

上海枫岭生物技术公司 FTC2000 上海枫岭生物技术公司
厦门安普利生物工程有限公司 FluoScan 9700 厦门安普利生物工程有限公司

杭州博日科技有限公司 FQD-33A ￥428,000 杭州博日科技有限公司

深圳Hema公司 Hema荧光定量PCR ￥98,000 深圳Hema公司
表一

荧光定量PCR仪技术指标比较
荧光定量PCR简单讲即温控设备pcr和荧光检测系统、计算机及软件系统。
关于温控，包括温度的均一性、升降温速度。主要是介质问题。理想的介质是要求导热性好、比热大、接触紧密。
水浴和油浴：温控的首选，比热大（油比水更大）、与反应物无缝接触，效果当然最好。
缺点不能自动化、小型化，只有最初的水浴锅式使用。
硅加热：Peltier这是使用最普遍的一种，优点：易自动化、速度快、直接加热降温，效果当然好，
缺点1、成本较高；
2、第二其使用的介质是金属，导热虽然好，但是与反应管，很难做到无缝接触，定性时代可以加油，但用荧光定量，由于油有荧光信号不能用。所以在无缝接触上差一些。
空气加热：与反应体系无缝接触
缺点：空气的导热性差、比热小的弱点明显。因此空气加热的要利用离心来产生空气流动，增强导热性，同时使用毛细管，加大接触面积、试剂微量化来弥补。这样做了以后效果还是不错。
同时，使用离心，对标本量增大是有影响的，并且标本量越大，空气比热小的弱点就越明显，所以空气加热的仪器标本量都比较小。使用毛细管后由于反应液与管的接触面积增大，吸附现象更大，因此试剂的通用性差，一般要专门开发，成本高，虽然试剂用量少，但因为是专用试剂，每人份就是以实际量算，并不省试剂。反而增加了毛细管成本。
关于功能，所有的PCR仪功能都大体相同。只有MJ孔间能使用不同温度比较独特，这对于多项目同时检测以及循环参数的调整比较有用。但其实时荧光的仪器刚进入中国不久，

所以这样就可以把市面上的产品分两类，半导体Peltier和空气。
表一7家公司产品，其中罗氏的LightCycler和Corbert的RotorGene是用空气加热，其余是Peltier
当然加热还有电热丝+半导体，致冷还有压缩机
空气的加热的标本量为32/批，其他96/批，iCycler 能达到384/批，这也难怪，是扩增仪上加装定量模块而成，所以如果标本量大，建议不要用罗氏。一则会累死的。同时每个标本要分摊的标准曲线，对照成本太高，试剂也比较受限。

监测系统：
光源，钨灯、激光、发光二极管
检测器：摄像头、光电二极管、光电倍增管PMT
型号 激发光源 检测器
PRISM 7900高通量型 Argon Laser 全光谱 CCD Camera
7000型
LightCycler Siger LED 固定的滤光片 Photohybrids
Opticon 96 LED 固定的滤光片 光电倍增管PMT
Opticon2多色荧光 固定的滤光片 光电倍增管PMT 2个
iCycler iQ Tungsten/Halogen 滤光轮 CCD Camera
Mx3000P Tungsten/Halogen
固定的滤光片 光电倍增管PMT
Mx4000 固定的滤光片 光电倍增管PMT4个
SmartCycler 4 LED/well 固定的滤光片 Photodlodes 4/well

现在好的定量PCR还有3个牌子
就是澳大利亚Corbett Research、美国的SmartCycle和Stratagene。
尤其是SmartCycle，在美国定量PCR这领域快和ABI平起平坐了
远超过MJ、Roche等！

我们有SmartCycle 的PCR仪.趁此机会给他也介绍一下巴,不过只有英文,呵呵,本人水平有限啊
Cepheid* Smart Cycler* II Thermal Cycler†
Advanced optics allow more dye choices for real-time PCR
Real-time PCR thermal cycler performs amplification and fluorescent detection in a single unit. Samples are amplified and measured in proprietary sealable reaction tubes, which optimize rapid thermal transfer and optical sensitivity while reducing the possibility of contamination. Advanced four-channel optics provide sensitive detection and precise quantitation.
Flexible operation. Sixteen I-CORE* (Intelligent Cooling/heating Optical Reaction) modules function as independent thermal cycler/fluorometers. Each module can be programmed separately, allowing up to 16 different cycling/detection protocols to be performed simultaneously in one processing block. Multiple experimental runs can be started at different times, allowing several operators to use the instrument concurrently.

Fast processing. Very rapid, accurate heating and cooling cycles produce results in as little as 20 minutes. Sophisticated optics enable the measurement of fluorescence in four channels in each module at the same time. The use of multiple fluorescent dyes permits the detection of up to four targets in a single sample.

Sensitive detection. Growth curves are displayed in real time as amplification occurs, and the presence of amplified product is confirmed when the fluorescent signal crosses a user-determined threshold. Product can be detected over a broad range of target concentrations. A linear standard curve can be created from a serial dilution, allowing the determination of an unknown sample concentration. The system can be used with a variety of detection methods including Molecular Beacons, TaqMan* probes, Amplifluor* primers, and intercalating dyes such as SYBR* Green.

Powerful software. Smart Cycler Software v. 2.0 streamlines real-time PCR protocols, data analysis, and display. Using the software, threshold settings, protocols, and graph formats can be user-defined. Each module can be stopped after crossing a user-defined threshold, or transitioned to a melt analysis in order to obtain the concentration or purity of a product. Two experimental runs can be monitored simultaneously and growth curves from different runs overlayed for easy comparison. Software also offers controlled access to protocols, graphs, and data.

Ordering Information: Standard Starter System includes a Smart Cycler II processing block, laptop computer or desktop computer with a flat-panel monitor, Smart Cycler Software v. 2.0, operator's manual, and accessory kit with a mini-centrifuge, tube racks, and cooling block. TD Starter System includes all of the components of the Standard Starter System, plus a carrying case for mobility. Ideal for environmental testing, biowarfare agent detection, plant diagnostics, and forensics. Add-on processing blocks are also available. Up to six processing blocks can be linked to one computer. Proprietary PCR reaction tubes must be ordered separately.



Specifications
Heating Ramp Rates (Max.) 10°C/sec. from 50° to 95°C
Cooling Ramp Rates (Max.) 2.5°C/sec. from 95° to 50°C
Temperature Duration Accuracy ±1.0 sec. from programmed time
Temperature Accuracy ±0.5°C from 60° to 95°C
Melt Curve Programmable Ramp Rates 0.1°C/sec. to 1.0°C/sec.
Processing Block L x W x H 10 x 12 x 12 in. (25.4 x 30.5 x 30.5cm)
Processing Block Net Weight 22 lb. (10kg)
Electrical Requirements 100?240VAC, 50?60Hz, 350w


有下列几种主机选择:
Desktop Systems :
Standard Starter System和Standard Starter System w/2 processing blocks
Laptop Systems:
Standard Starter System ; TD Starter System ; Standard Starter System w/2 processing blocks
附件:Add-On Processing Block
价格嘛,便宜的3万多,贵的7万多 都是美金价格.
如果有意向做代理的可以联系我.
美国FISHER科学世界公司广州办事处
TEL:13924096543
EMAIL:weihua.kong@fishersci.com.cn
CONTACT:Mr. 孔