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噬菌体展示文库中的终止密码子

   日期:2023-08-02     浏览:146    
核心提示:噬菌体展示通俗的理解就是把要表达的蛋白与噬菌体的外壳蛋白融合表达,使蛋白表达到噬菌体表面,当然在这个过程中需要保证蛋白的

噬菌体展示通俗的理解就是把要表达的蛋白与噬菌体的外壳蛋白融合表达,使蛋白表达到噬菌体表面,当然在这个过程中需要保证蛋白的结构和功能不发生改变。因为蛋白质保持了其本身的活性,所以可以通过特异的反应鉴定筛选出表达有活性蛋白的噬菌体。该技术将蛋白的表型和基因型直接联系了起来,可以实现高通量的筛选。

噬菌体展示文库可广泛用于选择针对多种不同抗原的抗体。噬菌体展示抗体(PDA)文库可以快速分离和鉴定用于治疗和诊断的高特异性单克隆抗体。噬菌体展示抗体文库可以分为免疫库、天然库和随机肽库。为了创建尽可能大的抗体库,随机肽库越来越受到关注,目前已经产生了很多合成和半合成抗体库。噬菌体展示抗体文库本质上是一种建库和筛选技术,这里我们重点关注将外源基因插入噬菌体外壳基因,使其表达到噬菌体外壳的建库步骤。

为了在丝状噬菌体表面上显示抗体可变区并随后回收可溶性抗体,将琥珀终止密码子(TAG)置于抗体的编码区和噬菌体外壳蛋白pIII之间。这种琥珀终止密码子TAG在大肠杆菌抑制菌株如TG1或XL1 blue中表达时,大约20%的时间翻译为谷氨酰胺,而另外80%的时间翻译为终止信号,因此将琥珀终止密码子编码为终止信号的克隆比将琥珀终止密码子编码为谷氨酰胺的克隆的数量更多,也就是说大多数噬菌体并没有将抗体展示到噬菌体表面。由于只有融合表达外源蛋白和噬菌体衣壳蛋白的噬菌体才有可能被筛选出来,而大多数的翻译终止,所以在抑制菌株中更容易筛选到抗原特异性噬菌体。一旦选择并克隆了抗原特异性噬菌体,就可以通过转换到大肠杆菌非抑制菌株如HB2151表达可溶性抗体。

然而,从合成和半合成文库中选择阳性结合克隆有一个固有的偏向,即克隆中会含有随机产生的琥珀终止密码子TAG,终止密码子的存在会减缓单链抗体的选择过程,并对单链抗体的分离和生产造成影响,这使得高亲和力结合抗体的鉴定变得复杂。正常情况下,包含终止密码子的单链抗体比例在10-30%之间波动,但对于某些特定的抗原选择方法,这一比例可能会增加到70-100%。尽管越来越多的研究人员正在利用这项技术,琥珀终止密码子在可变区中的频繁存在是一个很大程度上被忽视的问题,因为只有在阳性克隆不能通过可溶性ELISA实验鉴定出来的情况下,大家才会考虑终止密码子的问题。当单链抗体存在终止密码子时,抗原特异性抗体的选择之后必须进行定点诱变,以去除每个单链抗体中的终止密码子,这是一个相当繁琐的过程,因为每个单链抗体都需要设计不同的特异性引物,之后还要进行测序。因此可能的替代方案是表达可溶形式的抗体-pIII融合蛋白,但这也是有问题的——抗体-pIII融合蛋白在大肠杆菌中以较低水平表达,并且由于piii蛋白自发断裂其在功能上是异质的。由于这些原因,抗体-pIII融合蛋白的精确定量和亲和力测量也是困难的,而选择的有功能的抗体的关键问题是确定其在大肠杆菌中表达时的溶解度和与抗原结合的亲和力。

因此Marcus等人将琥珀终止密码子突变为谷氨酰胺密码子(CAG),Barderas等人将琥珀终止密码子突变成赭石终止密码子(TAA),使其仅表达可溶性的目标抗体而不表达噬菌体的衣壳蛋白pIII,这提供了一个解决方案。目前Perween等人已将TAA突变应用于SARS CoV 2,成功产生了抗SARS CoV 2 RBD的人源重组scfv抗体。


泰克噬菌体抗体展示技术平台服务优势:


--可溶抗原的快速制备能力:结合公司现有的重组蛋白表达体系,能够在短时间内制备出高纯度、高生物学活性的可溶抗原蛋白,用以支持噬菌体抗体的免疫及筛选工作。

--成熟稳定的免疫文库构建技术:目前我们获得的噬菌体一级免疫文库的库容可达10^8-10^9,其序列丰度>99%,保证直接筛选获得的抗体亲和力达到nM甚至pM级别。

--快速可靠的候选抗体筛选及初步鉴定技术:根据不同的抗体药功能需求,开发了多种筛选体系,包括直接筛选法、竞争法、负筛选法、细胞筛选法等。



 
 
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