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纳米抗体文库的选择

   日期:2023-08-14     浏览:211    
核心提示:抗体文库采用聚合酶链反应等手段在体外获得成套抗体可变区轻重链基因,将这些基因重组入一定的载体,转入适当的受体细胞或噬菌体

抗体文库


采用聚合酶链反应等手段在体外获得成套抗体可变区轻重链基因,将这些基因重组入一定的载体,转入适当的受体细胞或噬菌体中,这些抗体基因克隆的集合体称为抗体文库。从该文库中能够表达和筛选出所需的单克隆抗体。

纳米抗体文库


纳米抗体文库就是将抗体文库构建过程中的抗体序列换成了纳米抗体的序列,转入适当的受体细胞或噬菌体中即可得到相应文库。

纳米抗体文库的分类和传统抗体文库的分类一致,都可分为——免疫文库,天然文库和合成文库。下边我们一一介绍:


免疫纳米抗体文库


免疫纳米抗体文库就是要用特异的抗原对驼科动物进行免疫,通常需要免疫5次,大概需要6-8周,免疫之后取颈静脉血,分离PBMC/淋巴细胞提取rna,反转录获得cDNA,扩增VHH基因序列,将基因序列克隆至噬菌体展示载体,转化大肠杆菌即可获得免疫文库,文库库容通过长出的转化子个数来确定。之后利用该展示文库筛选表达目的抗体的噬菌体,去除不表达目的抗体的噬菌体,通过pcr扩增和单克隆测序来检测文库的抗体基因插入率和文库多样性。


图1 免疫纳米抗体文库构建+卡梅德生物.png 

图1 免疫纳米抗体文库


天然纳米抗体文库


在一些抗原无法进行免疫的情况下(比如抗原没有免疫原性或者抗原含有毒性),天然纳米抗体文库就比较有优势了。

天然文库不需要制备抗原对动物免疫,仅仅采集年轻健康的驼科动物的颈静脉血分离淋巴细胞提取RNA或者提取脾脏的RNA进行反转录获得cDNA,对VHH抗体的基因片段进行PCR扩增,将基因片段克隆至嗜菌粒载体上,转化TG1即可获得天然纳米抗体文库。因为使用了嗜菌粒载体,所以需要用辅助噬菌体(M13KO7、R408和 VCSM13)进行超染,才能使插入的基因展示在噬菌体表面。之后确定库容、筛选、鉴定文库的抗体基因插入率和文库多样性和之前说过的免疫纳米抗体文库的方法一致。


  图2 天然纳米抗体文库构建+卡梅德生物_副本.jpg

图2 天然纳米抗体文库


合成纳米抗体文库


然而为了得到高亲和力的抗体,通常需要构建一个库容达到109-1010文库并且其中高于80%的克隆应该都可以编码纳米抗体。为了构建一个库容较大且文库多样性丰富的天然纳米抗体文库,需要同时从不同的驼科动物抽取大量颈静脉血(如果想获得1010不同的VHH克隆,大概需要大于10升的血液),这也导致工作量的增加。因此,构建多样性丰富的合成纳米抗体库是更有意义的。

纳米抗体合成库的构建核心是人为创造出具有多样性的VHH片段,大致流程如下:

(1) 选择蛋白框架:与来自动物宿主的每个纳米体都有自己的框架区域不同,来自合成纳米体库的所有纳米体都需要共享相同的框架区域序列。共享的框架需要是稳定的、易表达的、高度通用的。纳米抗体合成库基本的框架是一致的,一种名为cAbBCII10的天然纳米抗体已被测试为合成纳米抗体文库框架的良好选择。

(2) 模板确定;

(3) 通过引物设计在CDR随机突变:文库的多样性体现在CDR,要确定突变CDR区的数量、每个CDR区的长度。一般CDR3区是确定亲和力和特异性的主要区域,可以仅对CDR3区突变,CDR3区可设计多个长度。为了防止插入终止密码子或者发生移码突变,目前通常使用三联核苷酸突变技术来合成引物。

(4) 合成模板和引物:考虑到合成库的有效性,需要保留重要氨基酸位点,比如形成二硫键Cys位点。设计的引物中应包含多样性的CDR区和重叠延伸时片段之间的重叠序列。

(5) 采用不对称和重叠PCR合成多样性的VHH片段:合成随机引物时,引物合成公司将在每个特定的位点添加混合碱基,每一个混合碱基池都是可以按一定比例定制。对于不同长度的CDR区,可以将每个长度制备成一个混合池,这些池可以在以后以特定的比例进一步混合,利用PCR技术重组VHH片段。

之后的文库筛选和验证也和之前讲过两种文库的相一致。


图3 合成纳米抗体文库构建+卡梅德生物_副本.jpg 

图3 合成纳米抗体文库构建及验证


三种纳米抗体文库的比较



免疫纳米抗体文库

天然纳米抗体文库

合成纳米抗体文库

是否需要免疫



是否需要取血



文库大小

106-108

109-1011
109-1015

其它

将获得亲和成熟的 Nbs

(相对)目标特异性结合剂的滴度较高

可用于非免疫原性靶标

一个文库可用于多个项目

Nbs可能需要改进稳定性/亲和性

可用于非免疫原性靶标

一个文库可用于多个项目

Nbs可能需要改进稳定性/亲和性

  

泰克生物致力于羊驼VHH抗体的产生已有9年多的时间,并拥有一支经验丰富的技术团队。据我们的实验项目数据统计,每年都有数百个羊驼VHH抗体构建服务成功交付。

泰克生物建立了一个完善的、成熟的噬菌体抗体展示技术平台。基于噬菌体展示技术平台,泰克生物可以提供包括抗原设计、羊驼免疫、文库构建与筛选、活性功能验证等主要实验环节,并为全球的科学家提供高特异性和高亲和力的驼科动物VHH抗体。


 
 
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